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生產(chǎn)感悟

 

來到生產(chǎn)一部細胞操作班已半年有余，在這之前曾在生產(chǎn)二部細胞操作班實習(xí)兩個月，通過兩個班的對比，發(fā)現(xiàn)有所不同之處是5L罐細胞的培養(yǎng)方式。一部5L罐細胞培養(yǎng)采用流加方式，二部5L罐細胞培養(yǎng)采用批培養(yǎng)方式。那么到底如何理解二者區(qū)別，把握二者細節(jié)，以便能更好的為生產(chǎn)服務(wù)呢？現(xiàn)將有關(guān)資料簡單整理，供大伙分享、探討。
分批培養(yǎng)是指將細胞和培養(yǎng)液一次性裝入反應(yīng)器內(nèi)進行培養(yǎng)，細胞不斷生產(chǎn)，產(chǎn)物不斷生成，經(jīng)一段時間反應(yīng)后將整個系統(tǒng)取出。
分批培養(yǎng)過程中細胞的生長可分為延滯期、對數(shù)生長期、減速期、平穩(wěn)期、衰退期等幾個階段。延滯期是指細胞接種到細胞分裂繁殖這段時間。延滯期的長短依環(huán)境條件的不同而異，受種子細胞本身的影響。細胞的延滯期是其分裂繁殖前的準備時間。一方面細胞適應(yīng)新的環(huán)境條件，另一方面，又不斷積累細胞繁殖所必須的一些生物活性物質(zhì)，使之達到一定濃度，進入對數(shù)生長期。細胞通過對數(shù)生長期迅速生長繁殖之后，由于環(huán)境條件的不斷變化，如營養(yǎng)物質(zhì)不足，抑制物的積累，細胞生長空間減少等原因，細胞經(jīng)過減速期進入平穩(wěn)期，這段時間內(nèi)，細胞生長和代謝緩慢，細胞數(shù)基本維持不變。經(jīng)過平穩(wěn)期之后，由于環(huán)境條件惡化，有時也可能由于細胞本身遺傳特性的改變，細胞逐漸進入衰退期而不斷死亡，或由于細胞內(nèi)某種酶的作用而使細胞發(fā)生自溶。
分批培養(yǎng)過程中細胞所處的環(huán)境隨時間變化很大，不能使細胞自始至終處于最優(yōu)條件下，根據(jù)細胞的這一生理特點，傳代最好依據(jù)嚴格的時間進行，這樣可以保持和監(jiān)控細胞的增殖行為。若到了該傳代的時間細胞還沒達到足夠的密度（即細胞沒有彼此匯合）則應(yīng)增加接種密度；相反，若細胞很快彼此匯合，則要降低接種密度。通過控制延滯期，將細胞的傳代時間控制在對數(shù)生長的中期，一旦這一常規(guī)程序建立起來，在一定的接種密度下細胞的周期性生長將與培養(yǎng)時間和細胞產(chǎn)量相一致。批培養(yǎng)的成功與這一原理緊密結(jié)合。
流加培養(yǎng)是指先將一定量培養(yǎng)液裝入反應(yīng)器，在適應(yīng)條件下接種細胞進行培養(yǎng)，細胞不斷生長，產(chǎn)物不斷生成。在此過程中，隨著細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，新的營養(yǎng)成分不斷補充至反應(yīng)期內(nèi)，使細胞進一步生長代謝，到反應(yīng)終止時取出整個系統(tǒng)。
流加培養(yǎng)的特點就是能夠調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的濃度，一方面可以避免在某種營養(yǎng)成分的初始濃度過高時影響細胞的生長代謝及產(chǎn)物的形成，另一方面還能防止某些限制性營養(yǎng)成分在培養(yǎng)過程中被耗盡而影響細胞的生長和產(chǎn)物的形成，這是流加培養(yǎng)和分批培養(yǎng)的明顯不同，流加培養(yǎng)能使細胞處于一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)。此外，在流加培養(yǎng)過程中，由于新鮮培養(yǎng)液的加入，因此整個過程的反應(yīng)體積是變化的，這也是它的一個重要特征。
流加過程設(shè)計的第一步是選擇和建立優(yōu)化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在培養(yǎng)過程中根據(jù)細胞生長的需求，通過補加營養(yǎng)物質(zhì)使其維持在一相對恒定濃度。
除營養(yǎng)物質(zhì)的流加外，其它一些因素也可延長細胞培養(yǎng)時間，如低DO和較低培養(yǎng)溫度（低于370C），在流加培養(yǎng)過程中這些因素都要綜合考慮。
在流加培養(yǎng)中為了達到高細胞密度，最大程度減少副產(chǎn)物的積累是十分必要的。雖然不少策略可減少乳酸和氨的積累，但只有很少措施（如降低流加量）可以可靠地在大規(guī)模培養(yǎng)中實現(xiàn)。
流加培養(yǎng)的控制是流加培養(yǎng)成功的關(guān)鍵，由于動物細胞代謝的復(fù)雜性以及調(diào)節(jié)產(chǎn)物合成的機制分泌因子的作用了解不夠深入，在動物細胞流加培養(yǎng)中關(guān)于檢測和控制的研究較少，關(guān)于營養(yǎng)物的流加速率和流加時間等參數(shù)的優(yōu)化都是憑經(jīng)驗完成。如NSO細胞培養(yǎng)中提高間歇流加頻率使培養(yǎng)液中營養(yǎng)物濃度提高，最終單克隆抗體濃度提高，連續(xù)流加則不能進一步提高單抗?jié)舛�。�?/span>Noe等發(fā)現(xiàn)在流加培養(yǎng)中從每天補加改為連續(xù)流加，提高了單克隆抗體的濃度。BHK-21細胞株在種子細胞生長均一穩(wěn)定的情況下，在設(shè)備功能與技術(shù)能力受限的情況下，采用何種流加方式能最大限度的提高細胞密度，并且細胞傳代時正處于對數(shù)生長中期。簡單點講就是在什么時候流加，加多少保證細胞處于對數(shù)生長期，不影響到下一代的生長和繁殖，我沒有找到相關(guān)的資料。希望我們能在此理論的指導(dǎo)下并與生產(chǎn)實際相結(jié)合，摸索出細胞流加培養(yǎng)的初始密度與初始培養(yǎng)體積、流加時間、流加量等相關(guān)的技術(shù)參數(shù)。
由于批培養(yǎng)操作簡便，容易掌握，因而是一種最常用的操作方式，而流加培養(yǎng)方式操作簡單可靠靈活，原則上勝過批培養(yǎng)。但作為一線的生產(chǎn)人員要在工作中善于觀察、勤于思考，尤其在培養(yǎng)基或其它參數(shù)有所更改時，更應(yīng)該做好每一批的觀察記錄，從中摸索出一個更適合生產(chǎn)，提高產(chǎn)能節(jié)約成本的經(jīng)驗值，使我們的產(chǎn)能和質(zhì)量再跨一個新的臺階。