王瀟娣，朱玲
　�。ㄋ拇ㄞr(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川雅安625014）
　　2011年8月，四川某豬場仔豬發(fā)生嚴(yán)重的腹瀉癥狀，豬只病初體溫升高、下痢、厭食，精神不振，呼吸困難，繼而出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，共濟(jì)失調(diào)，倒地四肢劃動(dòng)，最后衰竭死亡，死亡率高。解剖后可見肝臟有明顯的灰白色壞死灶，腦部充血明顯。通過流行病學(xué)調(diào)查和臨床癥狀可初步判定為偽狂犬病，但是無法確診。無菌采集病豬的腦組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室病原檢測，以弄清發(fā)病原因，提供更加豐富、完善的研究材料和臨床依據(jù)。
　　1材料與方法
　　1.1試驗(yàn)材料
　　1.1.1試驗(yàn)病料四川省某豬場發(fā)病仔豬的腦組織。1.1.2試驗(yàn)試劑  蛋白酶K、Tris-HCl、EDTA、NaCl、SDS、酚氯仿、無水乙醇、’rE、ddH20、2xGC buffer等。1.2試驗(yàn)方法
　　1.2.1引物設(shè)計(jì)根據(jù)豬偽狂犬病病毒的gE基因設(shè)計(jì)引物，引物序列如下。上游：5，-TGTGCTTCGA
　　GACCGCGTGCCA -3;下游：5,-TCGCCCACCGCCA
　　CAAAGAACA-37。預(yù)擴(kuò)增目的條帶大小為192 bp。1.2.2總DNA的提取
　�。�1）取出米粒大的的腦組織放入勻漿器里進(jìn)行勻漿。
　　（2）加500 vL消化Buffer （100 mg/L蛋白酶K、10 mmoVL Tris -HC1、15 mmol/L NaCl、10 mmol/L EDTA.4 g/L SDS pH8.0），充分混勻，56℃水浴5h 以上。期間要翻動(dòng)數(shù)次，使其充分混勻。
　�。�3）加500 pdL 25:24的酚氯仿，混勻，13 000 rl mm離心10 min。
　�。�4）取上清液，加等量的25:24的酚氯仿，混勻，13 000 r/min離心10 min。
　�。�5）取上清液，加2倍體積的無水乙醇，輕搖混勻，直到出現(xiàn)絮狀沉淀（未見沉淀提示DNA量不多）。
　　（6） 15 000 r/min離心3 mm。
　�。�7）去上清液，加500 pjL 70%乙醇，充分混勻，15 000 r/min離心3 rmn。
　�。�8）去上清液，晾干，加50 ~iL TE.完全溶解備用。1.2.3  PCR擴(kuò)增  向PCR管里加入4.5 VL ddH20、12.5 ~_cL 2xGC buffer.4 pLL dNTP、1.5 VL Mg2+、0.5 VL上游引物（20 pmol/IJ[L）、0.5.pLL下游引物（20 pmol/puD、rap酶0.5 pdL、1斗L上步抽提的DNA，共25 }_cL。PCR反應(yīng)程序：95℃變性5 min; 95℃35 s、50℃35 s.72℃30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 mm，4℃保存。
　　2結(jié)果
　　由圖1可見，從發(fā)病仔豬腦組織病料中擴(kuò)增出約200 bp的目的片段，與預(yù)擴(kuò)增目的條帶大小相吻合，且與陽性對照電泳條帶大小一致。結(jié)合臨床癥狀、剖檢病變及PCR檢測結(jié)果，可判定該豬群感染了偽狂犬病病毒野毒株。
　　3討論
　　豬偽狂犬病在生產(chǎn)中較為常見，在臨床上對仔豬的危害極大。豬自然感染本病的傳播途徑是鼻腔與口腔�？蓪�(dǎo)致仔豬的嚴(yán)重腹瀉和大量死亡。快速、準(zhǔn)確地檢測出豬只患病原因，對臨床上預(yù)防和治療具有積極的作用。
　　由于該病尚無特效藥物治療，所以預(yù)防該病的發(fā)生具有重要意義。目前免疫接種仍是預(yù)防和治療該病的主要措施。缺失gE糖蛋白的基因工程苗已經(jīng)成為世界首選使用的疫苗，能有效減輕豬感染后的臨床癥狀，大幅降低發(fā)病。
　　與其他疾病的鑒別診斷。由于偽狂犬病與其他疾病的I臨床癥狀有相似性，所以發(fā)病仔豬應(yīng)注意與豬李氏桿菌�。〝⊙�型）等相鑒別。李氏桿菌病導(dǎo)致仔豬全身衰弱，病程1-3 d，病料涂片鏡檢可見“V”或“Y”型排列的革蘭氏陽性小桿菌，用病料制成懸液接種家兔，不出現(xiàn)發(fā)癢撕咬局部的現(xiàn)象。